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即使樣品和流動相已做過前處理，也仍難以完成避免液相色譜分析柱受到污染，因此必須對柱子行清洗。清洗應定期進行，如果在短期內分析許多樣品，則以每日清洗一次為宜，至少也應一周一次，防止有太多的雜質在柱上堆積。
反相柱的常規洗滌辦法是：分別取甲醇、三氯甲烷、甲醇-水各20倍柱體積(既對于一根4.6mmX25cm的柱來說，通常是50-60ml，而對于9.4mm內經X50cm的柱來說，通常是500-600ml) ，使之通過柱子。
然后用流動相平衡(通常仍用20倍柱體積)，柱一般將恢復正常。如果選擇性仍和以前不一樣，則表明還有其他雜質留在柱子里，這時應考慮更加嚴格的清洗：先用20倍柱體積的水，再用相同體積0.05mol/L硫酸，zui后用流動相溶劑。酸洗常能洗下有機溶劑所不能洗下的剩余雜質。在低pH值下做長期(一天或更長)清洗是不適宜的，但50ml洗液以2ml/min的速度清洗25min，一般對健合相沒有損害。
注意，強堿不能用來清洗任何微粒硅膠柱(不論是健合相還是非健合相)，因為硅膠骨架會溶解。對于嚴重污染的反相柱，只能采用再生的方法。
液相色譜分析柱的再生處理包括活化(自右向左)和凈化(自左向右)兩種。
硅膠、氧化鋁和極性(正相)鍵合相色譜柱可以采用以下程序再生：
*基戊烷乙烷一三氯乙烷一乙酸乙酯一丙酮一乙醇一水采用上述溶劑依次以1ml/min的流速通過色譜柱，洗脫量約20ml。然后反方向重復上述過程。
反相色譜柱常用甲醇一水作流動相，有時還可能含有控制pH值的鹽、酸或離子型溶劑。對硅膠或以硅膠為基質的鍵合(或離子交換)填料，為避免硅膠溶解，pH值不應超過8.5。再生時將25ml甲醇：水(1：1)混合液依次通過色譜柱淋洗，然后用所有的流動相平衡。
